V klinických laboratóriách existuje niekoľko testov zameraných na dôkaz koronavírusu (SARS-CoV-2) a na akútne respiračné syndrómy. Lenže medzi rôznymi testami existuje veľké množstvo rozdielov. Tieto testy boli navyše rýchlo vyvinuté, minimálne štandardizované a neexistuje vhodná metóda spoliehajúca sa na hodnotenie kvality výsledkov. Okrem toho nie sú k dispozícii dobré odhady v diagnostickej citlivosti a špecifickosti. Dôraz sa viac kládol na diagnostickú citlivosť a je známe, že táto citlivosť je slabá, ak sa test vykoná príliš skoro – než dôjde k vylučovaniu detekovateľnej RNA. Vírusová RNA môže byť detekovateľná ešte určitý čas po aktívnej infekcii, hoci vírus nie je životaschopný alebo infekčný.
Falošné pozitívne výsledky závisia od dĺžky sond DNA, počtu a ktorých génov sa merajú a taktiež aj vplyvom technických chýb. Sondy DNA použité v testovacích súpravách rRT-PCR pre test SARS-CoV-2 sú dlhé iba asi 25 báz, čo nespĺňa odporúčanie pre molekulárnu diagnostiku infekcií vírusovými chorobami. Na základe nukleových kyselín, je potreba až 100 susedných báz. Rôzne metódy používajú rôzne iné gény a sondy, ktoré nemusia byť rovnaké. Medzi niektorými testami je 100-násobný rozdiel v limite detekcie. Technická chyba, najmä v dôsledku kontaminácie, môže spôsobiť falošné pozitívne výsledky. Po PCR nasleduje druhý krok na potvrdenie správnosti amplifikovanej látky, ako napríklad blotovacia metóda. RT-PCR sa zvyčajne používa na diagnostické účely (za účasti iných potrebných metód), nie na skríning. Tieto diagnostické metódy sa vykonávajú hlavne pri chronických vírusových infekciách, ako sú HCV, HIV a chronické HBV. Napriek tomu sú pri všetkých týchto chronických ochoreniach koncentrácie protilátok vysoké a sérológia zvyčajne predchádza rRT-PCR, takže falošné pozitívne nálezy sú zriedkavé. V súčasnosti prevaha je testovanie COVID-19 primárne rozšíreným skríningom bez potvrdenia.
Prvá vec, ktorú si musíme uvedomiť, je, že žiadny test nie je stopercentne dokonalý. Výsledky RT-PCR pomocou primérov v rôznych génoch môžu byť ľahko ovplyvnené variáciami sekvencií vírusovej RNA. V skutočnosti vzorka negatívnej kontroly templátu by mala byť negatívna a nemala by vykazovať žiadne krivky rastu fluorescencie, ktoré by prekračovali prahovú hranicu. Kontaminácia vzorky môže viesť k falošne pozitívnym výsledkom pri jednej alebo viacerých reakciách NTC priméru a sondy. Použitie 100 susediacich báz pre molekulárnu diagnostiku na báze nukleových kyselín pre infekcie vírusovými chorobami nie sú často splnené sondami použitými v testovacích súpravách rRT-PCR pre test SARS-CoV-2, ktoré sú väčšinou dlhé asi 25 báz. Po PCR by sa vždy mala vykonať druhá separačná technika. Chyby zosilnenia sú možné až priam časté v systémoch prekračujúcich prahovú hodnotu cyklu (Ct) 40. Detekcia iného vírusu alebo mikroorganizmu (iného ako SARS-CoV-2) sa tiež predpokladá ako jedna z pravdepodobných hypotéz falošne pozitívnych výsledkov spolu s interferenciou čistých technických artefaktov a pravdepodobnosťou krížovej kontaminácie. Miešanie vzoriek, chyby v údajoch a problémy so softvérom môžu tiež viesť k falošne pozitívnym výsledkom.
Hlavné príčiny, ktoré vedú k falošným pozitívnym výsledkom:
1. Vyskytla sa v tom čase nejaká simultánna vírusová infekcia RNA, ktorá mohla na ňu skrížene reagovať. PCR dokáže krížovou reakciou reagovať na tieto vírusy: (chrípka A, B, HCV – hepatitída C vírus, HDV – hepatitída D vírus, Togavírusy, Dengue vírus, Zika vírus rubeoly, arbovírusy, RSV -respiračný syncyciálny vírus, adenovírus, metapneumovírus, parainfluenza a bežné koronavírusy – HKU1, OC43, NL63, 229E. Sú známe falošne pozitívne správy spôsobené interakciou medzi dvoma RNA vírusmi. Falošne pozitívne výsledky boli preukázané aj z predoperačných prípadov, od 0,3 do 3%.
2. Čisto technické artefakty, pri ktorých sa generuje fluorescenčný signál v dôsledku nešpecifickej degradácie sondy nukleázou pravdepodobne spojenej s väzbou mimo cieľovej sondy. Pravdepodobne ide o spojenie so slabým pozitívnym signálom.
3. Detekcia iného vírusu alebo mikroorganizmu, ktorý nie je vírus SARS ‐ CoV ‐ 2 a ešte nebol zohľadnený v globálnych databázach použitých na vytvorenie primérov / sond v týchto testoch. Treba brať do úvahy že všetky tieto testy sú nové.
4. Technická krížová kontaminácia v ktoromkoľvek bode reťazca testovania (kontaminácia amplikónmi PCR, kontaminácia činidiel, krížová kontaminácia vzoriek) . Ak sa jedná o manuálny krok pipetovania, môže to byť technológ, ktorý omylom urobil chybu (napr. Tampón sa náhodne dotkne kontaminovanej rukavice alebo povrchu). V niektorých konfiguráciách prístrojov by to mohla byť udalosť kontaminácie vzorkou. Máme tendenciu dôverovať technike a prístrojom, ale nie sú neomylní.
Nižšie na obrázku máte možnosť vidieť mikrobiologický test na zistenie príslušných patogénov. Test patrí jednej pacientke, ktorá v decembri mala príznaky zahŕňajúc malátnosť, ospalosť, zimnica, strata čuchu, bolesť oka a hlavne gastrointestinálne problémy. Pacientka počas týchto príznakov bola pozitívna na COVID19 pomocou PCR testu vykonaného nazofaryngálneho výteru. V mesiaci január ju ešte trápili zimnice, malátnosť a strata energie. Z výsledku testov je očividné, že prekonala chrípku typu A, čo je klasická bežná vírusová infekcia a nakoľko ju ešte mierne symptómy trápili je viditeľné z dôkazu anti-influ A-IgG. Za bolestivý zápal oka a gastrointestinálne príznaky je zodpovedný adenovírus, ktorý sa na teste objavil ako pozit. Anti-adenovirus IgG. Treba pripomenúť, že pacientka mala aj hraničné hodnoty RSV (respiračný syncyciálny vírus), ktorý sa bežne objavuje za prítomnosti iných patogénov. Do popredia pomaly vstupovali aj baktérie Mycoplasma pneumoniae, ktoré tiež vykazovali hraničné hodnoty, no našťastie sa nerozvinuli do patologických stavov. Imunitný systém niečo udržal pod kontrolou, ale príznaky u nej aj tak pretrvávali.
Ako vidno z testov, tak všetky patogény navzájom spolupracujú. Jeden druh vírusu pod vplyvom reakcií imunitného systému pripravuje pôdu pre ďalšie iné patogény, aj v prípade, že je organizmus na ten mikrób odolný. Sme nosiči obrovského množstva vírusov a baktérií a dostanete je hocikde aj keď sa pred nimi efektívne chránite. Mnoho príznakov má na svedomí chrípkový vírus a iné k nemu bežné pridružené infekcie, vrátane bežných respiračných vírusov. Pri poklese imunity okamžite vstupujú do popredia. Väčšina PCR pozitívnych ľudí ani netuší, že má úplne iné patogény.
Veľká vďaka patrí Ela Yll za poskytnutie potrebných informácií a laboratórneho testu.
